軟瓊脂克隆實驗

軟瓊脂克隆實驗原理:
細胞接種存活率只表示接種細胞后貼壁的細胞數(shù)，但貼壁后的細胞不一定每個都能增殖和形成克隆。而形成克隆的細胞必為貼壁和有增殖活力的細胞?？寺⌒纬陕史从臣毎后w依賴性和增殖能力兩個重要性狀。
由于細胞生物學(xué)性狀不同，細胞克隆形成率差別也很大，一般初代培養(yǎng)細胞克隆形成率弱 ，傳代細胞系強;二倍體細胞克隆形成率弱，轉(zhuǎn)化細胞系強;正常細胞克隆形成率弱，腫瘤細胞強。并且克隆形成率與接種密度有一定關(guān)系， 做克隆形成率測定時 ，接種細胞定要分散成單細胞暴液,直接接種在碟皿中，持續(xù)一周,隨時檢查，到細胞形成克隆時終止培養(yǎng)。
軟瓊脂克隆實驗基本步驟:
(1)取對數(shù)生長期細胞，用0.25%胰蛋白酶消化并輕輕吹打，使之成為單細胞，作活細胞計數(shù)，用含20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液調(diào)整細胞密度至1x106細胞/L。然后根據(jù)實驗要求作梯度信數(shù)稀釋。
(2)用蒸餾水分別制備出1.2%和0.7%兩個濃度的低溶點瓊脂糖液,高壓滅菌后，維持在40°C中不會凝固。
(3)按1:1比例使1.2%的瓊脂糖和2xDMEM培養(yǎng)基(含有2x抗生素和20%的小牛血清)混合后,取3mL混臺液注入直徑6cm平皿中(10cm平皿加7-10mL)，冷卻凝固，可作底層瓊脂置CO₂溫箱中備用。
(4)按1:1比例讓0.7%的瓊脂糖和2 xDMEM培養(yǎng)基在無菌試管中相混以后,再向管中加入0.2mL的細胞懸液，充分混勻，注入鋪有1.2%瓊脂糖底層平皿中，逐形成雙瓊脂層。待上層瓊脂凝固后，置入37C 5%CO2溫箱中培養(yǎng)10-14天。
(5)把平皿放置在倒置顯微鏡下,觀察細胞克隆數(shù)。計算形成率。
軟瓊脂培養(yǎng)法常用檢測腫瘤細胞和轉(zhuǎn)化細胞系。試驗中瓊脂與細胞相混時，瓊脂溫度不直超過40°C。接種細胞的密度 每平方厘來不超過35個，一股6cm的平皿接種1000個細胞。正常細胞在懸浮狀態(tài)下不能增殖，不適用于軟瓊脂克隆形成試驗。